Immunogenicity of a Recombinant Gonadotropin-releasing Hormone Associated to the B Subunit of Escherichia coli Heat-labile Enterotoxin Expressed in Pichia pastoris and Escherichia coli Platforms

Abstract Gonadotropin-releasing hormone (GnRH) is one of the main targets for the development of immunocontraceptives vaccines. The aim of this study was to clone and express the recombinant GnRH fused to the B subunit of Escherichia coli heat-labile enterotoxin (LTB) molecule in Pichia pastoris and Escherichia coli platforms and evaluate their immunogenicity in mice. P. pastoris (pGnRH/LTB) and E. coli (eGnRH/LTB) platforms were able to express GnRH/LTB expected band with ~ 21 kDa. Both constructions were immunogenic in mice. Similar IgG kinetics was observed for both construction when it was used as ELISA antigen respectively, showing significant (p<0.05) IgG levels 5-fold higher than a commercial vaccine and 14-fold higher than the controls. The histological effects of pGnRH/LTB as well as eGnRH/LTB proteins demonstrated a significant effect on the gonads, characterized by atrophy of seminiferous tubules, absence of spermatogenesis and reduction of Leydig cells. Both constructions were able to induce antibodies that block the hormone effect, suggesting the potential of GnRH/LTB, independently of the P. pastoris or E. coli platform used, as a vaccine candidate for immunocontraception.

Male adult rat sperm parameters after skeletal muscle injury / Parâmetros espermáticos de ratos adultos após lesão músculo-esquelética / Parámetros espermáticos de ratas adultas después de lesión músculo-esquelética

ABSTRACT Introduction: Skeletal muscle injuries stimulate a systemic inflammatory response which may interfere in species reproduction. Objective: To evaluate the effects caused by skeletal muscle injuries on the inflammatory response and sperm parameters of male adult rats. Methods: The sample group was composed of 30 Wistar rats distributed evenly across control and injury groups. Muscle injury was induced by bruising, caused by the release of a 200 g weight from a height of 30 cm onto the gastrocnemius muscle. Blood (CBC and damage/muscle inflammation markers), muscle (oxidative stress) and gonad (sperm parameters) samples were collected 72h after the injury. Results: The muscle injury increased monocytes, creatine kinase, C-reactive protein, reactive oxygen species (ROS) concentration and lipid peroxidation. In contrast, the injury reduced antioxidant capacity against peroxyl radicals (ACAP), membrane integrity (36%) and sperm acrosome (33%). Membrane integrity and acrosome (p<0.05) correlate directly with ACAP (ρ=0.602; ρ=0.513 respectively) and inversely with monocytes (ρ=-0.703; ρ=-0.635, respectively), creatine kinase (ρ=-0.450; ρ=-0.603), C-reactive protein (ρ=-0.511; ρ=-0.703) and parameters of oxidative stress (ROS ρ=-0.703; ρ=-0.635; lipid peroxidation ρ=-0.494; ρ=-0.559). Conclusion: The acute systemic inflammatory response arising from skeletal muscle injury interferes in the male reproductive cell organelles (membrane and acrosome). Level of Evidence V; Experimental study.

RESUMO Introdução: As lesões músculo-esqueléticas estimulam uma resposta inflamatória sistêmica que pode interferir na reprodução das espécies. Objetivo: Avaliar os efeitos causados pelas lesões músculo-esqueléticas sobre a resposta inflamatória e os parâmetros espermáticos de ratos machos adultos. Métodos: O grupo da amostra foi composto por 30 ratos Wistar uniformemente distribuídos nos grupos controle e grupo lesionado. A lesão muscular foi induzida por meio de contusão, causada ao se soltar um peso de 200 g de uma altura de 30 cm sobre o músculo gastrocnêmio. Foram coletadas amostras de sangue (hemograma completo e marcadores de danos e inflamação muscular), músculo (estresse oxidativo) e gônadas (parâmetros espermáticos) 72 horas após a lesão. Resultados: A lesão muscular aumentou os monócitos, creatina quinase, proteína C-reativa, concentração de espécies reativas de oxigênio (ROS) e lipoperoxidação. Por outro lado, a lesão reduziu a capacidade antioxidante contra os radicais peroxil (ACAP), a integridade da membrana (36%) e o acrossoma espermático (33%). A integridade da membrana e o acrossoma (p<0,05) se correlacionaram diretamente com ACAP (ρ=0,602; ρ=0,513 respectivamente) e inversamente com os monócitos (ρ=-0,703; ρ=-0,635, respectivamente), creatina quinase (ρ=-0,450; ρ=-0,603), proteína C-reativa (ρ=-0,511; ρ=-0,703) e parâmetros de estresse oxidativo (ROS ρ=-0,703; ρ=-0,635; lipoperoxidação ρ=-0,494; ρ=-0,559). Conclusão: A resposta inflamatória sistêmica aguda decorrente da lesão músculo-esquelética interfere nas organelas das células reprodutivas masculinas (membrana e acrossoma). Nível de evidência V; Estudo experimental.

RESUMEN Introducción: Las lesiones músculo-esqueléticas estimulan una respuesta inflamatoria sistémica que puede interferir en la reproducción de las especies. Objetivo: Evaluar los efectos causados por las lesiones músculo-esqueléticas sobre la respuesta inflamatoria y los parámetros espermáticos de ratas macho adultas. Métodos: El grupo de la muestra fue compuesto por 30 ratas Wistar distribuidas uniformemente en los grupos control y grupo lesionado. La lesión muscular fue inducida por medio de contusión, causada al soltarse un peso de 200 g desde una altura de 30 cm sobre el músculo gastrocnemio. Fueron colectadas muestras de sangre (hemograma completo y marcadores de daños e inflamación muscular), músculo (estrés oxidativo) y gónadas (parámetros espermáticos) 72 horas después de la lesión. Resultados: La lesión muscular aumentó los monocitos, creatina quinasa, proteína C reactiva, concentración de especies reactivas de oxígeno (ROS) y lipoperoxidación. Por otro lado, la lesión redujo la capacidad antioxidante contra los radicales peroxilo (ACAP), la integridad de la membrana (36%) y el acrosoma espermático (33%). La integridad de la membrana y el acrosoma (p<0,05) se correlacionan directamente con ACAP (ρ=0,602; ρ=0,513 respectivamente) e inversamente con los monocitos (ρ=-0,703; ρ=-0,635, respectivamente), creatina quinasa (ρ=-0,450, ρ=-0,603), proteína C reactiva (ρ=-0,511; ρ=-0,703) y parámetros de estrés oxidativo (ROS ρ=-0,703; ρ=-0,635; lipoperoxidación ρ=-0,494; ρ=-0,559). Conclusión: La respuesta inflamatoria sistémica aguda proveniente de la lesión músculo-esquelética interfiere en los orgánulos de las células reproductivas masculinas (membrana y acrosoma). Nivel de evidencia V; Estudio experimental.

Olive oil as an alternative to boar semen cryopreservation / Aceite de oliva como una alternativa para la criopreservación de semen suino / O azeite de oliva como uma alternativa para a criopreservação do sêmen suíno

The aim of this study was to evaluate different concentrations of olive oil for cryopreservation of boar semen. A total of 21 eyaculates of 18 males with motility ≥70% were used. For freezing, the semen was diluted in treatments: control (Cont-egg yolk), "Koroneiki" oil in egg yolk at 0.25% (A025), 0.50% (A050), 0.75% (A075) and 1.0% (A10). Straws with 5.107 sperm/ml were frozen and stored in liquid nitrogen. Thawing was done at 37ºC for 30 seconds and motility, mitochondrial functionality, DNA integrity, oocite penetration rate and the number of sperm per oocite (in the in vitro penetration trial) were evaluated. The variables were compared using the Kruskal-Wallis test. Even though no statistical difference was found between control and treatments containingolive oil (p>0.05), the treatment with 0.25% oil concentration showed tendences towards sperm protection, outperforming the controls in mitochondrial functionality and preservation of the fertilizing capabilities in the in vitro penetration trial. This is why, olive oil could represent an alternative to help cryopreservation of boar semen.

El objetivo de este estudio fue evaluar diferentes concentraciones de aceite de oliva para la criopreservación de semen de verraco. Se utilizaron 21 eyaculados de 18 machos con motilidad igual o superior al 70%. Para la congelación, el semen se diluyó en los tratamientos: control (Cont) (lactosa yema), 0,25% (A025); 0,50% (A050); 0,75% (A075) y 1,0% (A10) de aceite de la variedad "Koroneiki" en lactosa yema. Pajas con 5.107 espermatozoides / ml, fueron congeladas y almacenadas en nitrógeno líquido. La descongelación se produjo a 37°C durante 30 segundos y se evaluó: la motilidad, la funcionalidad de la mitocondria, la integridad del ADN, la tasa de penetración de ovocitos y el número de espermatozoides por ovocito (en el ensayo de penetración in vitro). Las variables se compararon mediante la prueba de Kruskal-Wallis. Aunque no hubo diferencia estadística entre el control y los tratamientos que contienen aceite de oliva (p> 0,05), la concentración de 0,25% de este aceite mostró tendencias de protección de esperma, superando el control en la funcionalidad de las mitocondrias y en la preservación de la capacidad fertilizante en el ensayo de penetración in vitro. Por lo tanto, el aceite de oliva puede representar una alternativa para ayudar en la criopreservación de semen porcino

O objetivo de este estudo foi avaliar diferentes concentrações de azeite de oliva para a criopreservação de sêmen suíno. Utilizaram-se 21 ejaculados de 18 machos com motilidade igual ou superior ao 70%. Para o congelamento, o sêmen se dilui-o nos tratamentos: controle (Cont) (lactose-gema), 0,25% (A025); 0,50% (A050); 0,75% (A075) e 1,0% (A10) de azeite da variedade "Koroneiki" em lactose-gema. Palhetas com uma dose de 5.107 espermatozoides/ ml foram congeladas e armazenadas em nitrogênio liquido. O descongelamento se produz a 37°C durante 30 segundos e se avaliaram: motilidade, funcionalidade da mitocôndria, integridade do DNA, taxa de penetração de ovócitos e o número de espermatozoides por ovócito (no teste de penetração in vitro). As variáveis se compararam mediante o teste de Kruskal-Wallis. Ainda que não houve diferença estatística entre o controle e os tratamentos que continham azeite de oliva (p> 0,05), a concentração de 0,25% de azeite de oliva teve tendências de proteção do esperma, superando o controle na funcionalidade das mitocôndrias e na preservação da capacidade fertilizante no teste de penetração in vitro. Assim sendo, o azeite de oliva pode representar uma alternativa para ajudar na criopreservação do sêmen suíno.

Functional integrity of Colossoma macropomum (Cuvier, 1816) sperm cryopreserved with enriched extender solutions

Cryoprotectant solutions are used to protect the sperm from alterations caused by the low temperature in the cryopreservation process. We evaluated the quality of Colossoma macropomum semen after freezing, using dimethyl sulfoxide (DMSO) as a cryoprotectant, combined with two extender solutions (T1 - Solution 1: Glucose 90.0 g/L, Sodium Citrate 6.0 g/L, EDTA 1.5 g/L, Sodium Bicarbonate 1.5 g/L, Potassium Chloride 0.8 g/L, Gentamycin Sulphate 0.2 g/L, and T2 - Solution 2: Glucose 90.0 g/L, ACP(r)-104 10.0 g/L). Motility rate and motility time did not differ between T1 and T2 and were lower than fresh semen. The number of normal sperm was significantly different in treatments T1 (15.1%) and T2 (21.9%), and both showed a reduction in the percentage of normal sperm compared to fresh semen (57.4%). The values found for the rates of fertilization and hatching, mitochondrial functionality and sperm DNA, did not differ between the treatments (T1 and T2). Regarding membrane integrity, there was a higher percentage of spermatozoa with intact membranes in T1 (53.4%) than T2 (43.7%). The extender solutions, combined with 10% DMSO, maintained the sperm DNA intact in almost all the C. macropomumsperm cells, however there was a loss in their functionality.

As soluções crioprotetoras são utilizadas para proteger os espermatozoides das alterações causadas por baixas temperaturas durante o processo de criopreservação. Avaliamos a qualidade do sêmen de Colossoma macropomumapós o congelamento, utilizando dimetilsulfóxido (DMSO) como crioprotetor, combinado com duas soluções diluidoras (T1 - Solução 1: Glicose 90,0 g/L, Citrato de Sódio 6,0 g/L, EDTA 1,5 g/L, Bicarbonato de Sódio 1,5 g/L, Cloreto de Potássio 0,8 g/L, Sulfato de Gentamicina 0,2 g/L, e T2 - Solução 2: Glicose 90,0 g/L, ACP(r)-104 10,0 g/L). A taxa de motilidade (%) e o tempo de motilidade (s) não diferiram entre T1 e T2, porém foram mais baixos do que no sêmen fresco. O número de espermatozoides normais foi significativamente diferente nos tratamentos T1 (15,1%) e T2 (21,9%), e ambos mostraram uma redução na porcentagem de espermatozoides normais, comparado ao sêmen fresco (57,4%). Os valores encontrados para as taxas de fertilização e eclosão, funcionalidade mitocondrial e DNA do esperma, não diferiram entre os tratamentos (T1 e T2). Para a integridade da membrana, houve uma porcentagem mais elevada de espermatozóides com a membrana intacta em T1 (53,4%) do que T2 (43,7%). As soluções diluentes combinadas com DMSO a 10% preservaram o DNA espermático intacto em quase todas as células do sêmen de C. macropomum, mas houve perda na funcionalidade dos mesmos.

Concentração de lactato de cálcio e tempo de incubação sobre a capacidade de adesão e penetração de espermatozoides suínos na membrana perivitelina do ovo da galinha / Calcium lactate concentration and incubation period on the binding and penetration capacity of swine sperm in the perivitelline membrane of chicken egg

Este estudo testou o efeito de diferentes concentrações de lactato de cálcio e tempos de incubação sobre a capacidade de adesão e a penetração dos espermatozoides suínos nas membranas perivitelinas (MP) de ovos de galinhas, na expectativa de desenvolver um teste para estimar o potencial de fertilidade de machos doadores de sêmen. No primeiro experimento, amostras de sêmen (n=12) foram incubadas em meio TCM com lactato de cálcio a 1,1 e 2,2µg mL-1. Posteriormente, após definida a concentração de 1,1µg mL-1 de lactato de cálcio, um segundo experimento comparou três períodos de incubação a 39°C: 10, 15 e 20min. As respostas testadas foram: a taxa de adesão (TA) e o número de espermatozoides aderidos (NA) na MP externa, e a taxa de penetração (TP) e o número de orifícios (NO) na MP interna. A TA na MP externa foi de 100 por cento, independentemente da concentração e dos períodos testados. Com a concentração de lactato de cálcio de 1,1µg mL-1, o NA na membrana perivitelina externa e TP e NO na membrana perivitelina interna foram superiores (P<0,05) aos com 2,2µg mL-1. O NA foi superior com incubação por 20min, em comparação aos períodos mais curtos (P<0,05). No período de incubação por 10min, não houve penetração na MP interna. Porém, com 20min de incubação, a TP na MP interna e o NO foram superiores aos obtidos com a incubação por 15min (P<0,05). A concentração de 1,1µg mL-1 de lactato de cálcio e o perídodo de incubação por 20min permitem a execução eficiente de testes in vitro usando MP para verificar etapas importantes do processo de fertilização.

This study tested the effect of different calcium lactate concentrations and incubation periods on the binding and penetration capacity of swine sperm to the perivitelline layers (PL) of chicken eggs, with the expectation of developing a test to estimate the potential fertility of boars used as sperm donors. In the first experiment, semen samples (n=12) were incubated with TCM medium ant two calcium lactate levels: 1.1 and 2.2µg mL-1. After the set up of fixed calcium lactate level (1.1µg mL-1), the second experiment compared three incubation periods: 10, 15 and 20min. The observed variables were binding rate (BR) and number of bound sperm (NB) in the outer PL, and penetration rate (PR) and number of holes (NH) in the inner PL. The BR to the outer MP was 100 percent, regardless of the tested concentrations and incubation periods. The NB to the outer perivitelline layer and the PR and the NH in the inner perivitelline layer were greater with 1.1µg mL-1 calcium lactate than 2.2µg mL-1. The NB in the outer PL was greater with 20min incubation than with shorter period (P<0.05). Using 10min incubation, there was no penetration in the inner PL, but, with incubation for 20min, the PR and the NH in the inner PL were greater than those with incubation for 15 min (P<0.05). Using 1.1µg mL-1 calcium lactate and incubation for 20min, the in vitro test using PL can be efficiently conducted to assess important steps of the fertilization process.